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紫外分光光度計(jì)UV1901PC上海奧析科學(xué)儀器有限公司測(cè)酶激肽釋放酶原激活劑測(cè)定法

本法系采用顯色底物法（或顯色基質(zhì)法）測(cè)定供試品中激

肽釋放酶原激活劑（P KA )含量。

試劑 （1) 0. 0 5m o l/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸（Tris-

HC1)緩沖液(含0. 15mol/L氯化鈉溶液，簡(jiǎn)稱TNB) 稱取

6 .06g三羥甲基氨基甲烷（T ris，分子量為121.14)及8. 77g

氯化鈉，加適量水溶解后，用lm o l/L鹽酸調(diào)p H 值至8 .0，

補(bǔ)加水至1000mlD

(2)2m m ol/L激肽釋放酶顯色底物（S~2302)溶液稱取

S-2302 12. 5mg, 加 10ml 水溶解。

(3 )前激肽釋放酶（P K ) 采用適宜方法提純P K , 小體

積分裝，_3(TC以下保存?zhèn)溆谩?/span>

PKA標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備取P K A 標(biāo)準(zhǔn)品適量，用

0. 85%氣化鈉溶液分別稀釋成每lm l中含10. OIU. 20. 0 IU、

30.0IU、40.0IU、5 0 .0 IU的溶液。按每次用量，小體積分

裝，一3 0 t；保存?zhèn)溆谩Ｓ们叭诨▋H允許凍融1 次），并用

TN B稀釋10倍。

供試品溶液的制備取供試品適量，用T N B 稀釋

10倍。

測(cè)定法取供試品溶液20^1，加至9 6孔微量滴定板孔

內(nèi)，加PK 20.50^1，同時(shí)開(kāi)動(dòng)秒表計(jì)時(shí)，向每孔加P K 的

時(shí)間間隔應(yīng)相同，將微孔滴定板振蕩1分鐘；加蓋，于25.

30t；放置30分鐘后，按加P K 的順序和時(shí)間間隔向各反應(yīng)

孔加2mmol/L S-2302溶液2 0 j J ,振蕩1 分鐘；加蓋，于

25.30aC放置1 5分鐘后，再以同樣的加液順序和時(shí)間間隔

加50%醋酸溶液2 0 f J ,振蕩1 分鐘后，照紫外-可見(jiàn)分光光

度法（通則0401)，在波長(zhǎng)405nm處測(cè)定吸光度；同時(shí)以

TNB20.50F1代替PK 20.50卜1，同法操作，作為空白對(duì)

照，用P K A 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的2 (^1替代供試品溶液，同法操

作。以P K A 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的P K A活性的對(duì)數(shù)對(duì)其相應(yīng)的吸

光度對(duì)數(shù)作直線回歸，求得直線回歸方程，計(jì)算出供試品

P K A 活性。

【附注】（1 )每個(gè)P K A標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液做3孔，

其中2 個(gè)為測(cè)定孔、1 個(gè)為對(duì)照孔，2 個(gè)測(cè)定孔吸光度差值

應(yīng)小于0. 020。

(2 )每次測(cè)定可根據(jù)供試品P K A含量，適當(dāng)調(diào)整PKA

標(biāo)準(zhǔn)品溶液的范圍。

(3 )線性回歸的相關(guān)系數(shù)應(yīng)不低于0. 99。

(4 )加PK、士2302及50%醋酸溶液時(shí)，各孔的間隔時(shí)

間應(yīng)相同，加液的順序要一致，盡可能使各孔處于同一反應(yīng)

條件下。

(5 )加P K和加S~2302溶液后的放置時(shí)間系從*孔加

液時(shí)算起。

(6 )如放置溫度低于251C, 應(yīng)分別在兩次反應(yīng)過(guò)程的限

定時(shí)間內(nèi)于3 7 t：放置10分鐘。